酶联免疫吸附测定，即ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种结合可溶性抗原或抗体于固相载体（如聚苯）的定性和定量检测方法。该方法利用抗原与抗体之间的特异性结合，主要用于检测血清、尿液及细胞上清液中的特定抗原，从而实现定性判断。

ELISA的原理是将已知的抗原或抗体吸附于固相载体表面，使得与酶标记的抗原或抗体之间发生反应。这一过程通过设定标准孔、空白孔和样本孔进行。标准孔中加入100μL标品稀释液，空白孔加100μL标品和样本稀释液，其余的孔中则加入100μL待测样本。建议所有待检样本及标准品设立复孔，并通过预实验或咨询技术支持来确认样本的最佳稀释倍数。

在实验过程中，需将酶标板覆盖膜，37℃下孵育90分钟。在加样时，应尽量避免触及孔壁，并轻轻晃动以确保均匀混合，避免气泡生成。加样时间建议控制在10分钟之内；甩干孔内液体即可，不必洗涤。之后，每孔中加入100μL生物素化抗体工作液，随后再覆盖膜并于37℃下温育1小时。甩干孔内液体后，用洗涤液进行清洗，并重复此步骤三次，建议使用洗板机以提高效率。

接下来的步骤是加入100μL HRP酶结合物工作液，再次覆盖膜并在37℃下温育30分钟。完成后，再次甩干孔内液体并进行五次洗板。最终，每孔中加入90μL底物溶液(TMB)，继续在37℃避光孵育约15分钟，根据显色情况调整时间，但不应超过30分钟。当标准孔显现明显的颜色梯度时，实验即进入终止阶段。

为了准确测量，需提前15分钟开启酶标仪进行预热。然后，在每孔中加入50μL终止液，以终止反应。切记，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序保持一致。最后，在450nm波长下，使用酶标仪测量各孔的光密度(OD值)。由于实验操作的不同，标准曲线的OD值可能会有所差异，以下为实验室建立的标准曲线参考：NE浓度(ng/L)与相应OD值的关系。

对于血清、血浆或其他液体样本，通常100μL即可检测一个指标。若为未经处理的全血样本，1ml可分离出100-200μL血清，具体需根据实际送样情况而定。全血样本需在4℃下保存送检，而其他液体样本则应在-20℃下冻存。组织样本通常至少为0.1g（相当于黄豆大小），经过均质处理后可获得500μL左右的上清液，用于检测五个指标，同样需在-20℃下冻存后送检。我们的产品优质可靠，选择尊龙凯时，为您的实验数据保驾护航，助力您的研究进展。