一、RNA模板的制备

在生物医学研究中，RNA模板的制备是至关重要的一步。常用的RNA提取方法包括传统的酚-氯仿抽提法和柱式抽提法。以下将详细介绍这两种方法的操作流程，以Vazyme的相关产品为例。

### 1. 酚-氯仿抽提法

以Vazyme的RNAisolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme#R401)为基础，所需的材料包括：氯仿、异丙醇、75%乙醇（使用DEPC水配制）、DEPC水等。

#### 样本制备

在进行样本制备时，需要注意过多的样本量可能导致样本裂解不完全，从而降低产物纯度。对于1ml RNAisolater，其最大能充分裂解的样本量如下：

**贴壁细胞**：对于贴壁细胞（可使用细胞刮刀剥离），操作步骤为：

1. 弃去培养液，并用PBS洗涤一次。
2. 每10cm²培养面积的细胞加入1-3ml RNAisolater，确保其充分覆盖细胞表面，然后用移液器轻轻吹打细胞。
3. 将裂解液转移至15ml离心管中，用移液器反复吹打，直到无明显颗粒存在。最后在冰上静置5分钟。

**悬浮细胞**：操作步骤为：

1. 离心收集细胞，并用PBS洗涤一次。
2. 每5×10⁶-10⁷个细胞加入1ml RNAisolater，用移液器反复吹打至均匀悬浮，无颗粒存在，冰上静置5分钟。

**动物组织**：在液氮下进行研磨（研磨不彻底会影响RNA的得率和质量）：

1. 将液氮研磨的粉末迅速转移至离心管中，加入RNAisolater裂解液静置，待样品完全融化后再吹打，使裂解液透明。
2. 将裂解液转移至离心管中，以12,000×g在4℃离心5分钟，吸取上清。

**匀浆处理**：

1. 新鲜组织尽量剪碎放入RNAisolater裂解液中，用电动匀浆器高速匀浆，使组织完全均匀。
2. 将裂解液转移至离心管中，12,000×g在4℃离心5分钟，吸取上清。

### 2. 柱式抽提法

以Vazyme的FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme#RC101/RC111)为例，此方法所需材料包括：β-巯基乙醇、无水乙醇，及RNase-free枪头等。

#### 样本处理

**贴壁细胞**：直接使用Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇）进行裂解。如需消化，可用胰酶消化后离心收集细胞，加入Buffer RL1，每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1。用移液器反复吹打，直至看不到细胞团块。注意在使用前需在Buffer RL1中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%。

**悬浮细胞**：直接离心收集细胞，加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞加入500μl Buffer RL1，用移液器反复吹打直至细胞充分裂解。如不立即进行下一步操作，可将细胞置于-70℃保存。

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